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my photoJean-Pierre Raynauld, Biofísico

Université de Montréal


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He aqui la página Web de un capítulo que aparecerá en los « Proceedings of the NATO ASI on Neurobiology », que ocurrió en Erice, Sicilia, del 2 al 12 de mayo, 1995, y que estan ahora bajo prensa donde Plenun Press: « Neurobiology: Ionic Channels, Neurons, and the Brain: editado por V.Torre y F. Ponti, 1996 ». Los que se interesan en mas detalles pueden pedir el capítulo « A Compartment Model for Vertebrate Phototransduction Predicts Sensitivity and adaptation », p.p.201-215, escribiendome a la dirección que aparece al final de esta página. Les mandaré una versión Postcriptum o versión PDF del capítulo por FTP electrónico o un tirado aparte. La versión Postscríptum y los tirados aparte ya son disponibles .


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Un modelo de compartimentos de la fototransducción en los vertebrados

Resumen

Un modelo de compartimentos ha sido desarrollado para explicar las diferentes propiedades de los conos y de los bastones en la sensibilidad y en la adaptación. En el caso de los conos, el compartimento natural es el pliege de la membrana plasmática; mientras que en el caso de los bastones, el compartimento es definido empíricamente. En este modelo, la cantidad de compartimentos controla la amplitud de la respuesta a la acción de un fotón; el tamaño del compartimento determina la posición de la curva « Intensidad-Respuesta » sobre el axis de las intensidades. Utilisando el teorema de ergodicidad, fue possible predecir las propiedades de la adaptación a partír de la cantidad de compartimentos y de la constante de tiempo de la fase decreciente de la respuesta a un fotón.

Introducción

rod outer segmentSoy un biofísico al cual le interesa saber porque los conos y los bastones de los vertebrados presentan sensibilidades y propiedades de adaptación diferentes, a pesar de que la bioquímica de estos fenómenos sea tan parecida en estas dos clases de fotoreceptores. [1]

Como punto de partida, utilízo las diferencias anatómicas conocidas en la estructura externa de los fotoreceptores, magnificamente illustradas por Alfieri, R.et al. [2] (permisión requirida).


Figura 1: Bastones illustrando
el apilamento de discos en una concha cilíndrica.

cone outer segmentLa diferencia principal es que mientras en los conos los discos son plieges de la membrana plasmática, en los bastones, los discos son cerrados y apilados en una concha cilíndrica.

Ademas, un estudio tridimensional muestra que los plieges de los conos son estructuras casi completamente cerradas con una abertura de unos 20 grados en su circonferencia [3].


Figura 2: Illustración de un cono mostrando
que los plieges son parte integrante de la membrana plasmática.

Este modelo propone la existencia de compartimentos que limitan en volumen las reacciones bioquímicas consequentes de la captura de un fotón. Yo quisiera demostrar que en el caso de los conos, las membranas que forman los plieges determinan tambien el volumen o tamaño del compartimento. En el caso de los bastones, el compartimento es dicho « operacional », concepto que definiré mas lejos. Dos factores y una hipótesis son importantes para la discusión que sigue:

Intensidad-Respuesta

exponential saturation curveLa bioquímica responsable de la fototransducción ha sido estudiada intensamente durante los ultimos 15 años. El resultado esta bien illustrado en el esquema de Nakatani. La idea de que los segmentos externos de los fotoreceptores estan compartimentados no es nueva. Desde 1981, con el propósito de explicar la curva experimental de « Intensidad-Respuesta », Lamb et al. [4] dearrollaron el modelo de « oclusión total ». La curva resultante, llamada de « Saturación exponencial » puede ser utilisada en vez de la curva de « Michaelis-Menten »; su expresión matemática es: R/Rmax = 1 - Exp[-kI], donde « I » es la intensidad del flash y « k », un parámetro de ajuste. En este modelo, intentaré obtener la cantidad de compartimentos y sus tamaños. De estos resultados obtendré la respuesta a un fotón y el valor del parámetro « k ».


Figura 3:
Curva de « Intensidad-Respuesta »
en el modelo « oclusión total ».

Adaptación Weber-Fechner

Bajo una illuminación cuya intensidad no es suficiente para reducir la densidad del pigmento visual, la reducción de sensibilidad sigue una ley dicha de « Weber-Fechner », enunciada hace mas de un siglo. Esta ley muestra que la sensibilidad normalizada decrece con la intensidad de la luz ambiente " I " segun la relación « Io/(I + Io) », donde « Io » es la luz ambiente requirida para reducir la sensibilidad de un factor un medio. Es interesante observar ese un siglo antes de Weber y Fechner, el francés Pierre Bouguer era el primer para medir el efecto de la luz ambiente en umbral en el estado photopic. Su medida del umbral del incremento era 1/64 de la intensidad del fondo, un valor todavía validado hoy. Las propiedades de adaptación de un modelo de compartimentos no han sido estudiadas antes. Mi análisis es del tipo caja negra: despues de una isomerización que perturbe el compartimento, las reacciones que rigen la respuesta normalizada regresan a la situación de equilibrio que existía en la oscuridad. Entre todas las reacciones químicas que participan en este proceso, una sola es la limitante y hago la hipótesis que la forma de la fotocorriente refleja esa reacción controladora de la sensibilidad. Entonces importa definir la forma de la respuesta a un fotón y escogí la exponencial. En este esquema, despues de una isomerización, la corriente aumenta rapidamente y decrece de manera exponencial caracterizada por una constante de tiempo. Esto ne es una mala aproximación puesto que varios conos y bastones presentan tales respuestas. [5].

En mi análisis de un systema de compartimentos, me refiero a un teorema de mecánica estadística llamado teorema de ergodicidad que se enuncia asi : En un proceso estochástico estacionario, un gran numero de observaciones hechas en un solo sistema en « N » momentos arbitrarios tienen las mismas propiedades estadísticas que las observaciones hechas sobre « N » sistemas en un momento dado. Si me es permitida la equivalencia entre compartimento y sistema, puedo hacer el análisis de un compartimento bajo una luz dada y predecir la conducta del fotoreceptor, que en su totalidad, es una estructura formada de una cierta cantidad de compartimentos.

Weber-Fechner curve

Despues de una isomerización que produce una respuesta máxima (normalizada a 1) y decreciente exponencialmente según una constante de tiempo « T », la amplitud de la respuesta a un segundo fotón depende del tiempo pasado desde el fotón anterior y sera igual a « 1 - Exp[-t/T] ». Puesto que los intervales entre las isomerizaciones obedecen a la ley de Poisson, es posible simular una intensidad ambiente dada y encontrar la respuesta mediana del compartimento. Esto fue hecho en el programa de cálculo « Mathematica » y los resultados aparecen en los puntos de la figura 4. Se puede ver que los puntos se superponen exactamente a la curva Io/(I-Io). La conclusion es que un tal sistema se comporta exactamente como lo predice la ley « Weber-Fechner ». Esto representa una contribución mayor de este análisis.

Figura 4: Sensibilidad en función de la luz ambiente,
La curva « Weber-Fechner ».

El parámetro « Io », que hasta ahora servía unicamente para ajustar la curva a los datos experimentales, toma ahora una significación particular ligada a la estructura del segmento externo, es decir a la cantidad de compartimentos y a la constante de tiempo de la respuesta a un fotón. La relación siendo Io=N/T, donde « N » es la cantidad de compartimento y « T », la constante de tiempo de la decreciente exponencial.

El resultado final es que, del conocimiento del tamaño del compartimento, de la cantidad de compartimento y de la constante de tiempo asociada a la respuesta a un fotón, podemos predecir la amplitud de la respuesta unitaria y localizar absolutamente la posición de las curvas « Intensidad-Respuesta » y « Weber-Fechner » segun el axis de las intensidades.

Resultados y Discusión

El caso de los conos

Por una parte, la respuesta de los conos de mamífero a un flash de baja intensidad apunta con una latencia de 50 msec.; por otra parte, la iodopsina, la transducina y la fosfodiesterase, todas proteinas membranarias implicadas en la reacción en cascada, tienen coeficientes de difusión de 0,5 a 2 micróns cuadrados por sec.. Moviendose en un espacio bidimensional, muy pocas de estas moléculas activadas pueden salir del pliege membranario, cuyo diámetro es de 1,5 a 2 micróns, en un lapso tan corto de tiempo. Para el GMPc, que esta en solución y cuyo coeficiente de difusión es mas grande, hay que considerar en que medida las moléculas situadas en discos adjacentes al disco donde se produjo la isomerización, salen de estos y vienen a hydrolizarse en el disco activo. Hago la hipótesis de que, falta de tiempo, esta situación es un evento raro. En el interior del disco activo, se puede hacer un cálculo simple y mostrar que la cantidad de fosfodiesterase activadas puede exceder la cantidad de moléculas libres de GMPc. Existe entonces una posibilidad real de que una sola isomerización cause la cerradura de todos los canales iónicos de un disco o de un pliege de cono.

El primer resultado de este análisis es que, si en los conos, el disco forma un compartimento y que la respuesta al interior de ese compartimento es máxima, entonces la amplitud de la respuesta a un fotón es igual a 1/N, donde « N » es la cantidad de discos. La microscopía electrónica nos dice que la cantidad de discos por micrón es mas o menos de 33. La cantidad total de discos es entonces igual al largo del segmento externo multiplicado por 33. En el caso del cono de tortuga, ese número es mas o menos de 500; la respuesta predicha teóricamente despues de la acción de un fotón es un cambio de 0,2%, el valor obtenido experimentalmente es de 0,16% [6] en acuerdo con la predicción. Ayuda valiosa reciente de 2006[7] ofertas de los datos al modelo 1/N. En ratones genético modificados uno puede obtener los conos que tienen segmento externo de diversas longitudes y la sola respuesta del fotón de estos conos fue medida. Los ratones Gt alpha -/- tiene conos S and M con un segmento externo 13.4 micrones de largo y demuestran una sensibilidad a un fotón de 0.2 y 0.22 % de la respuesta máxima. Según el modelo 1/N, estos conos deben demostrar una respuesta a un fotón de % de 1/(13.4 x 33) o 0.23 %. Los ratones Nrl -/- tiene conos S con un segmento externo 7.1 micrones de largo y una sola respuesta del fotón de 0.44% cuando el modelo predice 1/(7.1 x 33) o 0.43%. Es difícil pedir una ayuda mejor para mi modelo. Otro resultado de este análisis es una hipótesis para explicar porque los conos son, por lo general, cortos. Effectivamente, si el hecho de agregar un disco aumenta la probabilidad de captura de un fotón, la respuesta disminuye de un factor 1/N a 1/(N+1). La naturaleza tuvo que hacer un compromiso entre capturar mas fotones y dar una respuesta adequada a la captura de esos fotones.

Conociendo las dimensiones del compartimento, es decir del disco o pliege plasmático, es posible calcular el valor del parámetro « k » en la fórmula de saturación exponencial [8]. Del valor de la densidad óptica del segmento externo y del de la eficacia quántica, se demuestra que « k » es igual a 0,00059 veces el cuadrado del diámetro del segmento externo expresado en micrones. Cuando derivamos esta fórmula, consideramos que el cono estaba estimulado transversalmente, lo que coresponde a la situación experimental. Esa derivación es válida tambien en el caso de un estímulo axial corespondiente a la situación fisiológica mientras el segmento externo no sea demasiado largo. En el caso de los conos de Macaca, el diámetro es mas o menos 1,5 micrón, el valor de « k » calculado es 0,001 micrones cuadrados, mientras que el valor obtenido experimentalmente es de 0.0004 [9] osea mas o menos la mitad.

Una estimación de la intensidad (medida en isomerización por sec.) necesaria para reducir la sensibilidad de 50% es obtenida dividiendo la cantidad de compartimentos (800 en los conos de tortuga) por la constante de tiempo que caracteriza la decreciente de la respuesta a un flash de baja intensidad. El cálculo da mas o menos 7300 para el valor de « Io ». Experimentalmente se obtienen valores entre 2000 y 16000 por sec. [10].

El caso de los bastones

En el caso de los bastones, el compartimento no esta definido por membranas como en el caso de los conos sino que por la combinación del hecho de que las proteinas activadas en la fototransducción tienen todas un tiempo de vida limitado y que el GMPc que controla la abertura de los canales tiene un coeficiente de difusión reducido en los alrededores del segmento externo. La respuesta de un bastón de mamífero apunta todos los 100 msec. mas o menos, esto permite la activación de mas moléculas de transducinas y de fosfodiesterase. La acción de la bioquímica puede dejar el espacio inter-discos y extenderse longitudinalmente. La geometría de apilamiento de los discos en el segmento externo de los bastones es importante. Para propagarse longitudinalmente, la reducción de GMPc debe reducir la concentración entre cada disco a lo largo de su recorrido. Esto limita la acción de la bioquímica. Estamos en presensia de un comportamiento dicho « operacional ».

Cálculos complejos en dinámica de los fluidos serian requiridos para determinar la concentración longitudinal de GMPc en los alrededores de la membrana plasmática despues de una isomerización en un disco. Sin embargo, una formula empírica fue obtenida del análisis de la respuesta a un fotón en varias especies. Esta relación dice que la superficie de membrana plasmática donde los canales iónicos estan cerrados es igual a la de un disco (o capas) del segmento externo. Un cálculo simple dice que al largo implicado debe ser igual al diámetro dividido por dos. Para los bastones de sapo, de rata, de monos y tambien de humano, la reducción de corriente predicha es 4 a 5%, osea el valor obtenido experimentalmente. Cálculos similares a los de los conos dan un valor de « k » para los bastones igual a 0,01 veces el cubo del diámetro del segmento externo expresado en micrones. Este cálculo permite localizar la curva « Intensidad-Respuesta » de manera absoluta sobre el axis de las intensidades. Para los bastones de mamífero, el valor calculado es de 0,08 micrones cuadrados; los valores experimentales varían entre 0.006 y 0.07. [8,11]

La cantidad de compartimentos " N " de un bastón es obtenido al dividir el largo total del segmento externo por d/2, esto da un valor cerca de 20. « Io » en la relación « Weber-Fechner » es entonces 20 dividido por la constante de tiempo de la decreciente exponencial. Para los bastones de los vertebrados superiores (hombres, monos), la predicción da un « Io » entre 110 y 113 isomerizaciones por sec. mientras que los resultados experimentales dan un valor entre 100 y 120 isomerizaciones por sec. [7,10]

Conclusión

El análisis de la estructura geométrica del segmento externo de los fotoreceptores de vertebrados a dado resultados interesantes.

Ademas, la validez del modelo puede ser testeada. Efectivamente, en los vertebrados a sangre fria, la cinetica de la respuesta a un flash varía con la temperatura[12] . Se puede ver si las propiedades de adaptación (Io) cambian según el modelo presentado aqui.

Vuestros comentarios son apreciados-correo electrónico:jean-pierre.raynauld@umontreal.ca


REFERENCIAS

1. Lamb TD, Pugh EN (1992) G-protein cascades: gain and kinetics . Trends Neurosci 15: 291-298.

2. Alfieri R, Sole P, Gentou C, Kantelip B, Kantelip J-P . (1984) Les cellules rétiniennes. Ed. D.G.P.L. Paris.

3. Eckmiller MS (1987) Cone Outer Segment Morphogenesis: Taper Change and Distal Invaginations. J Cell Biol 105: 2267-2277.

4. Lamb TD, McNaughton PA, Yau KW (1981) Spatial spread of activation and background desensitization in toad rod outer segments. J Physiol 319: 463-496.

5. Corson DW, Cornwall MC, MacNichol EF, Tsang S, Derguini F, Crouch RK,Nakanishi K (1994) Relief of opsin desensitization and prolonged excitation of rod photoreceptors by 9-desmethylretinal. Proc Natl Acad Sci USA 91: 6958-6962.

6. Baylor DA, Hodgkin AL (1973) Detection and resolution of visual stimuli by turtle photoreceptors. J Physiol 234: 163-198

7 Nikonov SS, Kholodenko R, Lem J, and Pugh EN. (2006). Physiological features of the S- and M-cone Photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J.Gen. Physiol. 127(4), 359-374

8. Baylor DA., Nunn BJ, Schnapf JL (1984) The photocurrent noise and spectral sensitivities of rods of the monkey Macaca fascicularis. J Physiol 357: 575-607

9. Schnapf JL, Nunn BJ, Meister M, Baylor DA (1990) Visual transduction in cones of the monkey Macaca fascicularis. J Physiol 427: 681-713

10. Baylor DA, Hodgkin AL (1974) Change in time scale and sensitivity in turtle photoreceptors. J Physiol 242: 729-758.
Burkhardt DA (1994) Light adaptation and photopigment bleaching in cone photoreceptors in situ in the retina of the turtle. J Neurosci 14(3), 1091-1105.

11. Kraft TW, Schneeweis DM, Schnapf JL (1993) Visual Transduction in human photoreceptors. J Physiol 464: 747-765

12. Lamb TD (1984) Effects of temperature changes on toad rod photo currents. J Phsysiol 346: 557-578


Salido de mi bocal de pecesillos rojos
Jean-Pierre Raynauld
Traducido al castellano por Mario Villalón, Biofísico.
(last updated May 24th, 2007)